روشهای خارج کردن ترکیبات تداخل کننده
در حین لیز سلولی و بعد از آن ، ترکیبات تداخل کننده ای نظیر آنزیمهای پروتئولایتیک ، نمکها ، لیپیدها ، اسیدهای نوکلوئیک ، پلی ساکاریدها ، و فنل های گیاهی باید غیر فعال شده یا از نمونه تهیه شده خارج گردند .
در این بخش به توضیح این آلاینده ها و اثر آنها بر الکتروفورز 2 بعدی پرداخته و روشهای حذف آنها را شرح خواهیم داد .
پروتئازها
پروتئازهای موجود و حاضر در نمونه باید غیر فعال شوند تا از تخریب پروتئین ها جلو گیری شود . در غیر این صورت پروتئازها با شکستن پروتئین ها سبب پدیدار شدن نقاط مصنوعی در نمایه 2 بعدی می شوند . روشهای مختلفی برای مقابله با پروتئولیز ضمن آماده سازی نمونه وجود دارد . برای مثال استخراج پروتئین در PH بازی ، جوشاندن نمونه در SDS و همچنین استفاده از مهار کننده های پروتئازها (PI) به تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر .
مهار کننده های پروتئاز را می توان به محلول لیز کننده افزود ، اما همیشه این کار توصیه نمی شود . چرا که این مواد ممکن است باعث ایجاد تغییر بار الکتریکی در پروتئین های دیگر شده و سبب ایجاد نقاط مصنوعی شوند . راه حل های دیگر جوشاندن نمونه در بافری با PH بالا نظیر بافر تریس است که دارای SDS باشند . برای غیر فعال کردن پروتئاز ها با PH پایین از رسوب دادن با TCA 20% بر روی یخ می توان بهره برد .
این نکته را باید در نظر داشت که غیر فعال سازی کامل تمام پروتئازها کاری بسیار سخت است . رسوب دهی توسط TCA و استن در کاهش تخریب پروتئین ها و خارج ساختن ترکیبات تداخل کننده معمولا مفید است . اما باید کاملا مراقب بود که پروتئین ها در اثر رسوب دادن ناقص و یا بعد از رسوب دادن ، در حین محلول کردن دوباره ، از دست نروند . نشان داده شده است که محلول های حاوی تیواوره 2 مولار و اوره 7 مولار کارآیی قابل توجهی در مهار کردن پروتئازهای نمونه دارند . تیواوره علاوه بر مفید بودن در حل کردن پروتئین ها به عنوان یک مهار کننده قوی پروتئازها نیز عمل می کند .
اسیدهای نوکلوئیک
حضور اسیدهای نوکلوئیک نیز می تواند در حین IEF مسئله ساز شود . این امر ناشی از افزایش در ویسکوزیته نمونه و در بعضی از موارد ایجاد کمپلکس هایی با پروتئین ها ی نمونه است که منجر به مهاجرت غیر عادی و ایجاد رگه های افقی و عمودی در نمایه ژل الکتروفورز 2 بعدی می شود . اگر مشکلاتی از این قبیل بوجود آید بهترین کار متلاشی کردن اسید نوکلوئیک با یک اندونوکلوئاز خالص و مناسب و عاری از پروتئاز است . روش دیگر استفاده از توانایی آمفولیت ها در ایجاد کمپلکس با اسیدهای نوکلوئیک و بعد خارج کردن این کمپلکس ها با اولترا سانتریفوژ است .
نمک ها
نمکها با تغییر در رسانایی و قدرت عبور جریان الکتریکی در ژلهای IPG باعث اختلال در IEF شده و تا زمانی که یونهای نمک از انتهای نوارهای IPG خارج نشوند فوکوسینگ پروتئین ها اتفاق نخواهد افتاد . همین امر زمان فوکوسینگ را افزایش می دهد . حضور نمک در نمونه ، ممکن است باعث جابجایی آب موجود در نوار IPG نیز شود . به طوریکه یک سمت ژل خشک و سمت دیگر متورم خواهد شد . از طرف دیگر وجود مقادیر زیاد نمک در نمونه باعث می شود پروتئین ها در نواحی نسبتا عریضی در دو انتهای ژل فوکوس نشوند . به همین دلایل نمک اضافی موجود در نمونه ها باید خارج شوند ، یا به کمترین حد ممکن تقلیل یابند . همانطور که قبلا اشاره شده است باید غلظت نمک موجود در نمونه کمتر از 40 میلی مولار باشد . زمانیکه نمونه در حین خیساندن ژل بار گیری می شود ، باید غلظت نمک کمتر از 10 میلی مولار باشد .
برای نمک زدایی از روشهای مختلفی می توان استفاده کرد ، که رایج ترین آنها استفاده از دیالیز ، تغلیظ کننده های غشائی ، ژل فیلتراسیون و رسوب دهی است . دیالیز روشی بسیار کارامد است ، که در آن کمترین مقدار از نمونه از دست داده می شود . اما دارای روندی طولانی مدت است و احتیاج به حجم بالایی از محلول دارد . تغلیظ کننده ها ی غشایی یا دیالیز همراه با سانتریفوژ روش سریع تری هستند . اما امکان اتصال پروتئین ها با غشاء دیالیز در این روش بیشتر است . در ژل فیلتراسیون نیز امکان از دست رفتن پروتئین های نمونه زیاد است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
نظرات شما عزیزان:
|
روز بخير كاربر مهمان! 
